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              凋亡檢測試劑盒操作步驟
              點擊次數:1676 發布時間:2021-03-15

                                                                                                                                  

              Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 凋亡檢測試劑盒說明書

              Annexin V-Alexa Fluor 647/PI Apoptosis Detection Kit 

               

              貨號:K2577     

              保存:2-8  ℃避光保存 

               

              組分說明

               

              Cat.No.                    K2577

              KitSize                     50

              4×BindingBuffer            10ml

              PropidiumIodide,PI          500 μl

              AnnexinV-AlexaFluor647    250 μl

               

              產品簡介 

               

                 AnnexinV-AlexaFluor647/PI凋亡檢測試劑盒是一種采用AnnexinV-AlexaFluor647PI 雙染法進行細胞早期凋亡分析的檢測試劑盒。

                 細胞凋亡早期改變發生在細胞膜表面,這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜內轉移到細胞膜外,使PS 暴露在細胞膜外表面。PS 是一種帶負電荷的磷脂,正常主要存在于細胞膜的內面,在細胞發生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。Annexin V具有易于結合到磷脂類如 PS 的特性,對PS 有高度的親和性。因此,該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。PS 轉移到細胞膜外不是凋亡所*的,也可發生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的,而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就被破壞。另外一種活細胞非透過性熒光染料碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)不能通過完整的活細胞,但能夠對壞死和凋亡晚期的細胞進行染色,因此通常將 AnnexinV PI 配合染色,以區別凋亡早期細胞與壞死細胞和凋亡的晚期細胞。

               

              注意事項 

               

              1.  消化細胞時不能用含EDTA 的胰酶。 

              2.  本試劑盒需使用流式細胞儀進行檢測。

              3.  需自備PBS 和去離子水。

              4.  熒光染料均存在淬滅問題,保存和使用過程中請盡量注意避光,以減緩熒光淬滅。

              5.  PI 對人體有刺激性,請注意適當防護。

              6.  請穿實驗服并戴一次性手套操作。

               

              操作步驟 

               

              1. 細胞樣品的準備:

               

                  a. 對于貼壁細胞:小心收集細胞培養液到一離心管內備用。用胰酶消化細胞,至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時,加入前面收集的細胞培養液,吹打下所有的貼壁細胞,并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內。1000×g 左右離心3-5 分鐘,沉淀細胞。對于特定的細胞,如果細胞沉淀不充分,可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約50 μl 左右的培養液,以避免吸走細胞。加入約1 ml 4℃預冷的    PBS,重懸細胞,再次離心沉淀細胞,小心吸除上清。再次加入1ml4℃預冷的 PBS,重懸細胞,再次離心沉淀細胞。

                  b. 對于懸浮細胞:1000×g 左右離心3-5 分鐘,沉淀細胞。對于特定的細胞,如果細胞沉淀不充分,可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約                            50 微升左右的培養液,以避免吸走細胞。加入約 1 ml 4℃預冷的PBS,重懸細胞,并轉移到1.5 毫升離心管內。再次離心沉淀細胞,小心吸除上清,可以殘留約                                50μl 左右的   PBS,以避免吸走細胞。再次加入1ml4℃預冷的PBS,重懸細胞,再次離心沉淀細胞。

              2.  用去離子水按1:4 稀釋  BindingBuffer4mlBindingBuffer+12ml 去離子水);

              3.  250μlBindingBuffer 重新懸浮細胞,調節其濃度為1×106/ml;

              4.  100μl 的細胞懸液于5ml 流式管中,加入5μlAnnexinV/AlexaFluor647 和  10μl20μg/ml PI 溶液;

              5.  混勻后于室溫避光孵育15 分鐘;

              6.  在反應管中加400μlPBS,流式細胞儀(FACS)分析。

                  

              實驗代做服務:

               

              WB代做

              HE染色

              免疫熒光染色

              蛋白相互作用分析

              ELISA免費代檢測

              免疫組化

              熒光定量PCR

              番紅O固綠染色

              流式細胞檢測

              激光共聚焦

              透射電鏡服務

              DNA甲基化實驗

              免疫共沉淀(Co-IP

              DNA甲基化

              掃描電鏡實驗

              microRNA 測序

              半定量RT-PCR

              分子克隆和質粒載體構建服務

              原位雜交(FIsh

              石蠟/冰凍切片

              RNA結合蛋白免疫沉淀(RIP

              CCK8檢測

              蛋白雙向(2-D)電泳

              蛋白雙向2D-WB

              ATP/ADP檢測

              Taqman探針

              細胞劃痕

              基因組DNA提取

               

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