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              β-葡萄糖苷酶(β-GC)活性檢測試劑盒說明書
              點擊次數:77 發布時間:2023-10-11

              β-葡萄糖苷酶(β-GC)活性檢測試劑盒說明書

              注意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

              規格:100T/48S

              產品內容:

              提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。


              微量法


              試劑一:粉劑×1 瓶,-20℃保存;臨用前每瓶加入 12mL 雙蒸水,充分溶解備用;用不完的試劑仍-20℃保存。

              試劑二:液體 15mL×1 瓶,4℃保存。試劑三:液體 15mL×1 瓶,4℃保存。

              標準品:液體 1mL×1 支,5μmol/mL 的對硝基苯酚溶液。

              產品說明:

              β-GC(EC 3.2.1.21)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,催化β-糖苷鍵水解,具有多方面生理作用:在纖維素的糖化作用中,β-GC 負責進一步水解纖維素二糖和纖維素寡糖生成葡萄糖;β-GC 水解萜烯類香氣前驅體,使糖苷鍵合態變成游離態。從而產生香味;β-GC 能夠水解植物體內野黑櫻苷,釋放 HCN,從而防止昆蟲取食。

              β-GC 分解對-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成對-硝基苯酚,后者在 400nm 有最大吸收峰,通過測定吸光值升高速率來計算β-GC 活性。

              試驗中所需的儀器和試劑:

              可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水

              操作步驟:

              一、粗酶液提?。?/span>

              1、細菌或培養細胞的處理:收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照每 1000 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液,超聲波破碎細菌或細胞(功率 20%,超聲 3s,間隔 10s,重復 30 次),15000g, 4℃,離心 20min,取上清,置冰上待測。

              2、組織的處理:稱取約 0.2g 組織,加入 1mL 提取液進行冰浴勻漿;15000g,4℃,離心 20min,取上清,置冰上待測。

              3、標準樣品的準備:取 100μL 標準液,加入到 400μL 試劑三中,得到 1μmol/mL 標準液,十倍稀釋到 100nmol/mL,用蒸餾水倍比稀釋:50、25、12.5、6.25nmol/mL。100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL 做標準液。

              二、測定步驟

              1.分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,調節波長至 400nm,蒸餾水調零。


              2.加樣表

              試劑名稱(μL)測定管對照管標準管

              試劑一120

              試劑二150150

              樣本3030

              充分混勻,放入 37℃準確水浴 30min 后,立即放入沸水浴中煮沸 5min(蓋緊,以防止水分散失),流水冷卻后充分混勻(以保證濃度不變)


              充分混勻,8000g,4℃,離心 5min,取上清液(在 EP 管或 96 孔板中加入下列試劑)




              充分混勻,室溫靜置 2min 后,400nm 處測定吸光值 A,計算ΔA=A 測定管-A 對照管。三、β-GC 活力計算:

              1、標準曲線建立:根據標準管的濃度(y)和吸光度(減去濃度為 0 標準管的 OD 值,x),建立標準曲線。

              2、根據標準曲線,將ΔA(x)帶入公式計算樣品產物濃度(nmol/mL)。

              (1)按樣本蛋白濃度計算:

              單位的定義:每 mg 組織蛋白每小時產生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

              β-GC 活力(U/mg prot)=(y×V 反總)÷(V 樣×Cpr)÷T=20×y÷Cpr

              需要另外測定,建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒。

              (2)按樣本鮮重計算:

              單位的定義:每 g 組織在每小時產生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

              β-GC 活力(U/g 鮮重) = (y×V 反總)÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=20×y÷W

              (3)按細菌或細胞數量計算:

              單位的定義:每 1 萬個細菌或細胞每小時產生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

              β-GC 活力(U/104 cell)=(y×V 反總)÷(1000×V 樣÷V 樣總)÷T=0.02×y

              Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;V 反總:反應體系總體積,0.3mL;V 樣:加入反應體系中樣本體積,0.03mL;V 樣總:加入提取液體積,1mL;W:樣品鮮重,g;1000:細胞或細菌總數,1000 萬;T:反應時間,0.5h。

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