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              碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase ,CA)試劑盒說明書

              提 供 商: 上海研謹生物科技有限公司 資料大?。?/td>
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              碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase ,CA)試劑盒說明書

              微量法 100 管/96 樣

              正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

              測定意義:

              碳酸酐酶(CarbonicAnhydrase ,CA)是一種含鋅金屬酶,迄今在哺乳動物體內已發現至少有  11種同工酶,它們的結構、分布、性質各異, 多與各種上皮細胞泌H-和碳酸氫鹽有關,通  過催化CO2水化反應及某些脂、醛類水化反應, 參與多種離子交換 ,維持機體內環境穩態。 測定原理:

              碳酸酐酶具有酯酶活性, 可催化乙酸對硝基苯酯反應生成對硝基苯酚, 通過檢測 405nm 處 吸光值上升速率反映碳酸酐酶活性。

              需自備的儀器和用品:

              酶標儀、水浴鍋、可調式移液器、 96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

              試劑的組成和配制:

              提取液:液體 50mL×2 瓶, 4℃保存;

              試劑一:液體 20mL×1 瓶, 4℃保存;

              試劑二: 粉劑×1 瓶, -20℃避光保存; 臨用前加入 5mL 試劑三,充分溶解待用, 用不完的 試劑繼續-20℃避光保存。

              試劑三:液體 6mL×1 瓶, 4℃保存。

              樣品測定的準備:

              1、細菌或細胞的處理:收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量 (104 個): 提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液), 超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3S,間隔 10S,重復

              30 次) ;8000g ,4℃離心 10min,取上清, 置冰上待測。

              2、組織的處理:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液) ,冰浴中勻漿。 8000g  ,4℃離心 10min,取上清, 置冰上待測。 測定步驟

              1 、酶標儀預熱 30min,調節波長至 405nm。

              2 、試劑一、試劑二提前 25℃預熱 10min。

              3 、取 96 孔板,依次加入 20μL 樣本上清, 140μL 試劑一, 最后加入 40μL 試劑二。立刻混 勻, 測定 405nm 下 3min 處吸光值 A1  與 6min 處吸光值 A2 ,ΔA=A2-A1


              CA 活力計算:

              標準條件下測定回歸方程為 y = 1.0424x + 0.001,R2 = 0.9994;x 為標準品濃度(μmol/mL), y 為吸光值。

              1、按照蛋白濃度計算

              單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘催化產生 1nmol 對硝基酚定義為一個酶活力單位。

              CA 活性(nmol/min/mg prot)=(ΔA-0.001) ÷1.0424×V 樣÷(V 樣×Cpr)÷T×1000 =319.77×(ΔA-0.001) ÷Cpr

              2、按樣本鮮重計算

              單位的定義:每 g 組織每分鐘催化產生 1nmol  對硝基酚定義為一個酶活力單位。 CA 活性(nmol/min/g  鮮重)=(ΔA-0.001) ÷1.0424×V 樣÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T×1000



              =319.77×(ΔA-0.001) ÷W

              3、按細菌或細胞密度計算

              單位的定義: 每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產生 1nmol  對硝基酚定義為一個酶活力單位。

              CA 活性(nmol/min/104 cell)=(ΔA-0.001) ÷1.0424×V 樣÷(500 ×V 樣÷V 樣總)÷T×1000 =0.639×(ΔA-0.001)

              V 樣: 加入樣本體積: 0.02mL;V 樣總: 加入提取液體積, 1 mL;Cpr:樣本蛋白質濃度, mg/mL;W:樣本質量, g;500:細菌或細胞總數, 500 萬; T:反應時間, 3min;1000,μmol 到nmol 的換算系數。


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