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              多克隆抗體制備服務
              多克隆抗體制備服務
              更新時間:2020-03-16
              型    號:
              所屬分類:醫學免疫學實驗
              報    價:8000
              分享到:

              服務名稱: . 多克隆抗體制備服務
              提供商: 上海研謹生物
              規格: 實驗代做服務
              價格:8000元
              收費標準/服務周期/提供結果:
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              多克隆抗體制備服務產品概述:

              多克隆抗體制備服務

               

               

               

               

               

              多抗一般制備流程:*抗原的準備- +兔子的免疫-→ 效價檢測和終放- +抗體親和純化- +抗體的濃縮和保存。

               

              具體實驗步驟如下:

               

              1.兔子的準備

               

              挑選健康的6周大小的新西蘭大白兔兩只(約2Kg) ,使其適應新的生活環境,至少穩定幾天再進行*取血、預采血(作陰性參照用)

              1.1將兔子小心的放入固定的架中,使兔子平靜;

              1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可見(也可不剃);

              1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位使血管膨脹;

              1.4用注射器從耳靜脈抽取約10ml血液(約5ml血清);

              1.5小心抽出針頭,適當按壓傷口以免流血,然后用酒精棉球消毒傷口;

              1.6將收集的血液置于37 C滅活30min,后置于4" C過夜使其凝結釋放血清;

              1.7將凝結好的血液在10000r / min離心10min; h.收集 上清,即為血清。

               

              兔子的免疫

              2.1注射兩只兔子的抗原為1ml,抗原緩沖溶液必須不含對兔子有害的化學試劑每只兔子初次免疫400ug抗原比較適合,也可適當減少以獲得更好的結果,后續免疫每次為100ug即可。

              2.2將1m的佛氏*佐劑與準備好的1m抗原充分混勻,呈乳白色; .

              2.3小心從籠中取出兔子,織兔子免疫4個部位(背部和大腿根部均可),每個部位250ul,針頭呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留數秒以防止抗原外流。

              2.4兔疫周期為20天,免疫完后7-10天取血(包括中途測試取血和終放血),總共免疫4-5次。

               

              3.效價檢測

              3.1 2個參照陰性參照為預取血血清,均以1抗起始濃度稀釋(封閉稀釋液);陽性參照為以前

              陽性血清

              3.2于96孔板中每孔滴加100ul, 1ug/m抗原,于49C過夜, 也可以37°C孵育2小時。

              3.3倒掉抗原溶液,每孔加入200u的封閉液, 49C過夜或者379C孵育2小時。

              3.4倒去封閉液,在吸水紙上拍打盡量吸干殘留液體,用洗滌液洗板三次每次盡量拍干殘留液體,若要放置一段時間, 37°C烘干并用封口袋封好于20°C存放。

              3.5取包被好的96孔板,第---孔加入陰性 參照液100ul,第二孔加入陽性參照液100ul,第三孔加入1:500的待測抗血清,后續各孔在此基礎上倍比稀釋,于37°C孵育1 小時。

              3.6倒掉液體,用洗滌液洗板三次,拍干。每孔加入100u的HRP標記的小鼠抗兔lgG (1: 2000稀釋),于37°C孵育45分鐘。

              3.7倒掉液體,用洗滌液洗板三次,拍干。每孔加入100u的TMB底物(Sigma 單組份TMB ) 37°C孵育5-20分 鐘(根據顏色深淺來決定顯色的時間)。

              3.8每孔加入50u的終止液(2N H2SO4), 在酶標儀上讀取波長450nm處的吸光值。

              抗體效價檢測達到100萬以上后可以對兔子進行終放血。

               

              抗體的純化

               

              4.抗體的親和--親和柱的制備

              4.1 稱取1mg CNBr- Sepherose 4B的瓊脂糖凝膠加入2mmol/ L的鹽酸中,4" C過夜使其充分溶漲,可獲得3m溶漲膠。

              4.2將凝膠轉移入純化柱中,用約20ml 2mmol / L的鹽酸洗介質3次。

              4.3用偶聯緩沖液洗介質- -次,因為活化基團在偶聯緩沖液PH值下易水解,所以此步驟在幾分鐘內完成。

              4.4將溶解在5ml偶聯緩沖液中的5-10mg的抗原加入凝膠中

              4.5室溫下輕輕混合搖動2-4小時,或4" C過夜,如需測定結合效率此步驟結束后取少量溶液待測。用20ml的偶聯緩沖液洗介質一-次。

              4.6加入15m1 1% BSA溶液室溫下孵育2小時或4" C過夜。

              4.7用磷酸鹽緩沖液洗滌介質3次以上,每次15m以上h.

              4.8抗原固相化完成,可用于純化。

              4.9若不立即使用或者使用后,用20%的乙醇封存。

               

              5.抗血清的純化和保存

              5.1抗血清用PBS等體積稀釋,5000-10000 / min離心15分鐘,取上清.

              5.2用10倍體積的PBS清洗抗原親和柱以平衡柱子。

              5.3將稀釋好的抗血清10m加入平衡好的柱子中。

              5.4室溫下輕輕混合搖動2-4小時,或4" C過夜

              5.5用10倍體積的PBS清洗抗原柱,以洗去結合在柱子上的雜蛋白

              5.6用2倍體積的抗體洗脫液洗滌柱子,以得到特異性抗體

              5.7用10倍體積PBS平衡柱子

              5.8用20%的酒精封存柱子,4'C保存。

              在得到洗脫的抗體后,經蔗糖或聚乙二醇濃縮后于PBS中透析除鹽,使用紫外可見分光光度計在波長280nm處測定抗體OD值,所得OD值除以1.35即為所測抗體的濃度,添加40-50%甘油置于20^C可長期保存。

               

               

              部分實驗代做服務

              ELISA試劑盒免費代檢測

              CCK8檢測

              基因組DNA提取

               

              蛋白相互作用分析

              Western Blot

               

              免疫組化

              熒光定量PCR

              動物模型服務

              流式細胞檢測

              細胞增殖

              激光共聚焦

              DNA甲基化實驗

              細胞劃痕

              鈣離子濃度檢測

              掃描電鏡實驗

              microRNA 測序

              動物實驗

              Taqman探針

              ATP/ADP檢測

               

              石蠟/冰凍切片

              定點突變

              線粒體膜電位(MMP)檢測

              細胞生長曲線的測定

              藥理毒理動物實驗

               

              免疫共沉淀

              真核表達載體構建

              染色質免疫沉淀CHIP

              非標定量(Label-free)實驗

              留言框

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